1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料利用新疆伊犁河恰甫其海水庫養(yǎng)殖的哲羅鮭(Huchotaimen)親魚21多尾，培育在(3×20)m2的長方形流水養(yǎng)魚池中,，進(jìn)排水量約(15~20)m3/h,，在水溫達(dá)到8℃時(shí)對雄魚注射促黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)2.5μg/kg和絨毛膜促性腺激素(hu-manchorionicgonadotropin,HCG)400IU/kg催熟,，雄魚成熟后采用擠壓腹部法收集精液,，采精時(shí)避免光線直射，將精液直接收集在50mL玻璃瓶中,，置于事先放入冰塊的保溫盒中,，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷凍保存實(shí)驗(yàn)。MVE液氮罐

1.2精子稀釋液的配制和篩選利用市售NaCl,、KCl,、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O,、Na2,、HPO4、NaHCO3,、NaH2PO4,、KHCO3、KOH,、MgSO4,、KH2PO4,、葡萄糖、蔗糖,、檸檬酸,、Tris、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS),、N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine),、蛋黃、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)配制了9種精子稀釋液和冷凍保存液：MPRS,、RS,、Hanks,、ELS,、EG1、EG2,、Stein,、SS-2、D15(表1),。分別利用以上精子稀釋液以1：1的比例稀釋精液,，平衡5min后，利用OLYMPUS顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力(運(yùn)動(dòng)精子/全部精子數(shù)),。然后分別在以上稀釋液中加入20%的DMSO,，再以1：1的比例稀釋精液，平衡5min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力,。最后將稀釋后的精液分裝在2mL冷凍管中,，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮中,。冷凍3~4h后,，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力,。

表1精子稀釋液配方

 

1.3抗凍劑(甲醇和二甲基亞砜)濃度的篩選以ELS為稀釋液,，分別以終濃度為4%、6%,、8%,、10%和12%加入抗凍劑甲醇(methanol)和DMSO，稀釋精液在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力,。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中,，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮罐中,。冷凍3~4h后,，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力。

1.4葡萄糖濃度的篩選以D15為基礎(chǔ)稀釋液,，在其中分別加入15%,、20%、25%,、30%,、35%和40%的葡萄糖，再加入終濃度6%甲醇,，以1：1的比例稀釋精液,，在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中,，每管注入稀釋精液1mL,，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍5h后,，利用37℃水浴解凍精子,，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)精子活力。

1.5哲羅鮭精子在不同稀釋液中短期冷藏保存分別以D15,、D30,、Stein和ELS為稀釋液，以1：1的比例稀釋哲羅鮭精液,，分別注入2mL冷凍管中,，每管注入1.5mL，同時(shí)以未加稀釋液的鮮精作對照,，將冷凍管置于保溫盒中,，保溫盒中事先放入體積1/3的冰塊，保存溫度2~4℃,。每隔5h在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)一次精子活力,，直至精子完全失活。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA),，采用Student-Newman-Keuls進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析,，篩選精子活力最高的精子稀釋液配方、抗凍劑成份和濃度,。利用Excel軟件對統(tǒng)計(jì)結(jié)果做圖,，在圖中利用a、b,、c后d等字母表示分析結(jié)果之間的顯著性差異,，字母相同為無顯著性差異(P>0.05)，字母不同具顯著性差異(P<0.05),。MVE液氮罐